Выращивание микроорганизмов на средах, содержащих стабильные изотопы

Для многих целей, и прежде всего для структурных исследований белков, биотехнология предлагает альтернативный химическому синтезу путь получения изотопномеченых аминокислот и белков, который приводит к высоким выходам синтезируемых продуктов, к эффективному включению изотопов в молекулы соединений, и, самое главное, к сохранению природной конфигурации (стереоселективности) конечных продуктов [55, 56]. Метод заключается в выращивании штаммов-продуцентов необходимых БАС на ростовых средах, содержащих различные субстраты, представляющие собой органические соединения и неорганические соли, содержащие стабильные изотопы 2Н, 13С, 15N и 18О [57-61].

ешающее значение для биотехнологического получения изотопномеченых аминокислот и белков имеет правильный выбор микроорганизмов, способных к устойчивому росту на средах, содержащих стабильные изотопы и к продукции нужных БАС. Наиболее доступными объектами для получения многих изотопномеченых белков признаны микроводоросли, большое разнообразие которых в природе позволяет выбирать среди них отдельные виды, способные к эндогенному накоплению белков [62]. В то же время комплексное использование компонентов меченой биомассы микроводорослей позволяет выделять, например, [2H]аминокислоты, в том числе и гетеромеченые, из гидролизатов суммарных белков биомассы, выращенной на 2Н2O-среде [63]. Другие традиционные штаммы микроорганизмов также могут эффективно применяться для получения изотопномеченых аминокислот и белков. При этом основными требованиями к микроорганизмам, используемым для получения изотопномеченых соединений являются устойчивый рост на средах, содержащих стабильные изотопы и высокий уровень продукции нужных БАС, который можно повысить за счёт применения генно-инженерных методов, а также мутагенеза и селекции. Это создаёт предпосылки для конструирования новых бактериальных штаммов-продуцентов с заданными свойствами и для дальнейшего изучения их характеристик. Биотехнологический подход экономически целесообразен и особенно незаменим, когда необходимы высокая стереоселективность и максимальные уровни изотопного обогащения синтезируемых соединений.

При биотехнологическом получении изотопномеченых соединений используют несколько подходов, один из которых заключается в униформном обогащении стабильными изотопами клеточных БАС по всему углеродному скелету молекул. Это достигается за счёт выращивания микроорганизмов на средах, содержащих меченые субстраты высокого уровня изотопной чистоты и с последующим фракционированием компонентов биомассы на различные классы природных соединений [64]. Так, аминокислоты с униформным характером включения изотопной метки 13С по скелету молекулы получают, в основном, при выращивании автотрофных микроорганизмов на ростовых средах, содержащих вместо обычных углеродных субстратов исключительно их низкомолекулярные [13С]аналоги, например 13СО2 [65]. Таким способом были получены многие [13C]белки, синтезируемые микроводорослями: ферридоксин из Anabaena [66], цитохром C-553 [67], цитохром C2 из Rhodospirillum [68], и флаводоксин из Anabaena 7120 [69] и использованы для дальнейших ЯМР исследований. Для структурных исследований белков методом спектроскопии ЯМР, для которого необходимо, чтобы как можно больше атомов в молекуле были замещены на их стабильные изотопы, биосинтетические подходы по получению униформно меченых [13C]аминокислот могут обеспечить сравнительно недорогое получение нужного количества меченых [13C]продуктов [70]. [15N]аминокислоты получают аналогичным путём за счёт выращивания микроорганизмов на водных средах, содержащих К15NO3 или другие 15N-содержащие соли [71], в то время как высокообогащённые дейтерием аминокислоты можно получать с использованием ростовых сред, содержащих вместо обычной воды 99,9% 2H2O [72]. Однако, при этом необходимо учитывать эффекты, связанные с клеточной адаптацией к 2Н2O. Известно, что 2Н2О действует токсически на клетки, ингибируя жизненно-важные функции роста и развития многих микроорганизмов.

Однако, несмотря на негативный биостатический эффект 2Н2O, разные таксономические роды бактерий могут быть достаточно легко адаптированы к росту и биосинтезу на средах содержащих максимальные концентрации тяжелой воды [73], в то время как клетки высших растений способны выдерживать не более 60% 2Н2О [74], а животные клетки не более 30% [75]. С точки зрения физиологии и генетики адаптация клетки к 2Н2О является комплексным феноменом и может привести к изменениям активностей ферментативных реакций, что сказывается косвенно на структуре и функциях синтезируемых БАС, процессах биосинтеза и метаболизма и даже морфологии клетки. В связи с этим, разработка методов физиологической адаптации клетки к 2Н2О для получения высокообогащённых дейтерием БАС является весьма актуальной [76-78]. Следует также подчеркнуть, что исследования по адаптации биологических объектов к 2Н2О также должны учитывать химические изотопные эффекты, которые для изотопных пар протий/дейтерий могут быть аномально высокими [79]. При этом различают первичные и вторичные изотопные эффекты. К первичным изотопным эффектам следует отнести изменение констант скоростей химических реакций, протекающих в 2Н2О по отношению к таковым в обычной воде, измеренных как соотношение kH/k2H. Это соотношение меняется для различных связей, образованных с участием дейтерия и может варьировать в пределах от 7 до 10 единиц. К вторичным изотопным эффектам относятся изменения в констатнах скоростей химических реакций, обусловленных действием 2Н2О как растворителя (большая струрированность и вязкость, плотность, коэффициент диффузии и т. п.). Кроме того, следует помнить, что 2H2O является гидроскопическим соединением, активно поглощающем пары влаги из воздуха, неорганических солей среды, при стерилизации и т. п., и, следовательно, этапы, связанные с выращиванием бактерий на 2H2O-средах необходимо проводить в герметических условиях с использованием безводных реагентов, предварительно перекристаллизованных в 2Н2O неорганических солей и т. п. [18O]аминокислоты можно получать за счёт выращивания микроорганизмов на средах, содержащих другой изотопный аналог воды - H218O. Адаптация клеток к H218O в данном случае не является лимитирующим этапом. Однако, H218O используется в качестве источника изотопной метки в редких случаях, главным образом, вследствие высокой стоимости изотопных соединений кислорода [80].

Селективного включения стабильных изотопов в определённые положения молекул аминокислот и белков можно достичь за счёт применения комбинации меченых и немеченых субстратов в ростовых средах [81], меченых предшественников аминокислот [82], или при использовании ауксотрофных по определённым аминокислотам штаммов микроорганизмов [83]. Для этих целей очень хорошо подходит такая распространённая бактерия как E. coli, биосинтез аминокислот в которой к настоящему времени изучен наиболее детально и для которой получен многочисленный набор мутантных форм [84].

Очень часто, разветвлённые пути метаболизма меченых аминокислот в клетке приводят к специфическому мечению других биосинтетически родственных аминокислот за счёт использования клеткой многочисленных минорных путей биосинтеза и сопряжённых реакций метаболизма. В некоторых случаях этот фактор может существенно облегчить процесс получения селективно меченых белков и аминокислот. Таким способом был получен [15N]Т4-лизоцим, с селективным характером включения метки 15N лишь по остаткам глутамата, глутамина и аргинина [85]. В работах [86, 87] сообщается о получении других индивидуальных [15N]белков, селективно меченных изотопом 15N по остаткам гистидина и лизина.