Водородный обмен на дейтерий и тритий

О.В. Мосин
ВОДОРОДНЫЙ ОБМЕН НА ДЕЙТЕРИЙ И ТРИТИЙ В МАКРОМОЛЕКУЛАХ БЕЛКОВ И ДНК.

При растворении многих веществ в дейтериевой (D₂O) или тритиевой (³Н₂О) воде происходит обмен атомов водорода на дейтерий D или тритий ³Н.

Изотопный обмен характеризуется как самопроизвольное перераспределение изотопов химического элемента между различными фазами системы (в частности, между различными агрегатными состояниями одного и того же вещества), частицами (молекулами, ионами) или внутри молекул (сложных ионов).

При изотопном обмене сохраняется неизменным элементный состав каждого участвующего в обмене вещества, изменяется лишь его изотопный состав.

Распределение изотопов между веществами в состоянии равновесия характеризуется коэффициентом распределения, определяющим соотношение равновесных концентраций изотопов в реагирующих веществах. При равномерном распределении изотопов коэффициент распределения равен 1.

Однако, на практике равномерное распределение изотопов в реагирующих веществах происходит только для изотопов лёгких элементов.

Для лёгких изотопов углерода, азота и кислорода с небольшими разницами атомных масс при достижении химического равновесия изотопного обмена каждый изотоп распределяется между реагирующими веществами равномерно.

Для изотопов тяжёлых элементов дейтерия и трития эта неравномерность в распределении между некоторыми веществами может достигатьсотен процентов.

Отклонение от равномерного распределения зависит не только от массы изотопов, но и от химического состава веществ, между которыми происходит изотопный обмен. Кроме того, коэффициент распределения зависит от температуры и во всех случаях по мере её повышения приближается к 1.

Скорость протекания изотопного обмена определяется механизмом реакций. В некоторых случаях изотопный обмен протекает практически мгновенно (например, при ионных реакциях в растворе), в других случаях — крайне медленно или же не происходит вовсе. Для ускорения изотопного обмена так же, как и для других химических реакций, часто используют различные катализаторы.

Так, при помещении молекулы в тяжёлую/тритиевую воду происходит довольно быстрый изотопный (Н-D-T)-обмен протонов на дейтерий/тритий в гидроксильных -ОН, карбоксильных -СООН, сульфгидрильных –SH, аминогруппах –NH2 и амидных –NH всех органических соединений, включая нуклеиновые кислоты, липиды, белки и сахара. Известно, что в этих условиях только С-Н связь не подвергается изотопному обмену и вследствие этого только соединения со связями типа С-D (С-T) могут синтезироваться de novo.

При помещении молекулы в тяжёлую/тритиевую воду происходит быстрый изотопный (¹Н-²H-³Н)-обмен в гидроксильных -ОН, карбоксильных -СООН, сульфгидрильных –SH, аминогруппах –NH2 и амидных –NH всех органических соединений, включая нуклеиновые кислоты, липиды, белки и сахара. Известно, что в этих условиях только С-Н связь не подвергается изотопному обмену и вследствие этого только соединения со связями типа С-²H (С-³H) могут синтезироваться de novo.

Кроме вышеобозначенных эффектов, возможное изменение энергетики самой дейтериевой/тритиевой связи, что может сказаться на стабильность макромолекул. Изотопные эффекты дейтерия и трития связаны с образованием в тяжёлой/тритиевой воде конформаций молекул с иными структурно-динамическими свойствами, чем конформаций, образованных с участием водорода, и поэтому имеющих другую активность и биологические свойства. Так, в случае с дейтерием разрыв С¹H-связей может происходить быстрее, чем С²H-связей, подвижность дейтерия меньше, чем подвижность протия, константа ионизации тяжёлой воды несколько меньше константы ионизации обычной воды. Изотопные эффекты дейтерия и трития связаны с их увеличенной массой по сравнению с протием и вследствие этого с кинетикой реакций, подвижностью, энергетикой и т.д.

Аминокислоты, нуклеозиды, короткие полипептиды, белки в конформации беспорядочного клубка и одноцепочечные нуклеино­вые кислоты быстро обменивают атомы водорода, связанные с ато­мами азота, кислорода и серы; атомы водорода, связанные с ато­мами углерода, обмениваются гораздо медленнее.

В белках, в силу их химических свойств, способные к обмену протоны боко­вых групп некоторых аминокислот (например гидрокси-группа ОН серина и амино-группа NH₂ глутамина и аспарагина) обмениваются намного быстрее, чем протоны пептидной связи или амидных групп глутамина и аспарагина. Эти два класса протонов – при гидроксиаминной и амидной группах различают по рН-зависимости скоростей водородного обмена — первый класс имеет минимум при рН 7, второй — при рН 3. Каждый класс протонов можно подразделить по принципу степени участия протонов в образовании водородных связей.

Поскольку скорость водородного обмена обычно гораздо меньше, чем скорость образования и разрыва водородных связей (которая контролирует доступ растворителя к группам, участ­вующим в образовании водородных связей), наблюдаемая ско­рость водородного обмена для любой группы есть произведение скорости водородного обмена на долю времени, в те­чение которого группа доступна растворителю. Таким образом, если протоны группы участвует в образовании водородной связи, то это должно приводить к понижению скорости водородного обмена.

Это происходит потому, что протоны в данных группах подвергается действию растворителя только тогда, когда имеет место локальный разрыв водородных связей. Следовательно, измеряя скорости водородного обмена для протонов открытых групп (например, в мономерах) и скорости обмена для аналогичных групп макромолекулы, можно определить в каждый данный момент времени долю протонов этих групп, не участвующих в образовании водородных связей.

В двухцепочечных нуклеиновых кислотах обмен протонов, участвующих в образовании водородных связей, значительно облегчается при действии агента, который разрывает водородные связи. Протон, потенциально спо­собный к быстрому обмену, обменивается плохо, если он образует водородную связь.

Этот факт можно использовать для определе­ния числа водородных связей, эффективности различных денату­рирующих агентов или динамического состояния макромолекулы. При первом применении этой методики рассматривали только дейтериевый обмен, потому что ³Н₂О была недоступна. Обнару­жение дейтерия было очень трудной задачей, которую решали либо масс-спектрометрией, либо путем инфракрасной спектрофотометрии. Как только стала доступной ³Н₂О, вместо дейтериевого обмена стали использовать тритиевый, поскольку тритий легко обнаруживать по радиоактивности.

Тритиевый обмен служит методом исследования структуры белка или ДНК. При этом требуется отделение макромолекул от ³Н₂О. Такого специфического разделения можно достигнуть с использованием заряженного геля, поскольку ³Н₂О сильно удерживается всеми гелями. Если поры геля имеют минимальный размер, макромолекулы выходят из геля без особого труда.

Рис. 1. Эксперимент по тритиевому обмену в белках.

Полипролин (А) и РНазу (Б) инкубировали в течение нескольких часов в ³Н₂О до достижения максимального обмена. Затем образцы растворяли водой и через различные промежутки времени наносили на колонку с сефадексом G-25 для разделения белка от ³Н₂О. На графике А отсутствует тритий, ассоциированный с полипролином, из чего следует, что либо водородный обмен не происходит, либо он происходит очень быстро. На графике Б показано, что в случае с РНКазой тритий связывается с белком. (из работы Englander W., Biochemistry, 2, 798-807 (1965).

Методика тритиевого обмена, в которой используется гель-проникающая хроматография на различных молекулярных ситах типа сефадекс (рис. 1), состоит в следующем. К белку или нуклеиновой кислоте в растворе Н₂О добавляют тритиевую воду. Через различные промежутки времени отбирают пробы и помещают их на колонку. ³Н₂О сильно задерживается колонкой, в то время как белки и нуклеиновые кислоты быстро проходят через нее. Используя колонку такой длины, что белок или нуклеиновая кис­лота проходят через нее за 10 секунд, концентрацию несвязанного трития понижают приблизительно в 108 раз.

Затем с колонки отбирают фрак­ции и радиоактивность каждой определяют методом сцинтилляционного счетчика; концентрацию белка или нуклеиновой кислоты определяют спектрофотометрически или с помощью цветных реакций на белок. Так можно измерить число обменявшихся атомов водорода, приходя­щееся на единицу массы или на молекулу (если известна моле­кулярная масса) как функцию времени.

Методом тритиевого обмена получено несколько важных результатов. Например, установлено, что протоны, участвующие в образова­нии водородных связей двухцепочечной ДНК, могут обмениваться. Из данных по кинетике изотопного обмена и равновесному рас­пределению изотопов и влиянию на них рН выяснено, что водо­родные связи в двухцепочечной ДНК постоянно разрушаются и образуются вновь; этот процесс назвали «дыханием» и предпо­ложили, что он лежит в основе возможного механизма таких процессов, как инициация синтеза ДНК и спаривание ДНК — ДНК при генетической рекомбинации.
Другой пример — определение числа водородных связей в тРНК путем измерения доли быстро обмениваемых протонов; эти данные были исполь­зованы учёными для подтверждения одной из предложенных структур тРНК.

В изотопных исследованиях с тяжёлой и тритиевой водой часто используют метод изотопного разбавления. Пусть надо проанализировать содержание со­единения А в смеси, которую невозможно количественно разде­лить на отдельные компоненты.

Эту задачу можно выполнить следующим образом. К смеси добавляют небольшое количество А, содержащего известную примесь радиоактивного изотопа. Единственное условие дальнейшего анализа состоит в том, что­бы можно было хотя бы частично отделить из смеси компонент А в чистом виде. Введем коэффициент разбавления, равный от­ношению удельной активности изотопа А до разбавления к удельной активности того же изотопа после разбавления. Для стабильных изотопов отношение концентраций конкретного изо­топа до и после разбавления во многих случаях можно опреде­лить с помощью масс-спектрометра. Исходя из коэффициента разбавления и количества добавленного компонента А, можно рассчитать концентрацию А в исходной смеси.

Метод изотопного разбавления можно использовать, например, для определения общего количества воды в организме. Для этого вводят известное количество воды, содержащей определен­ную примесь радиоактивного трития. Через некоторое время, тре­буемое для полного смешивания введенной воды с остальной ее частью, отбирают образец сыворотки крови и измеряют в нем удельную активность трития. Если при этом оказалось, что ко­эффициент разбавления равен, например, 800, то полное количе­ство воды в организме в 800 раз превышает объем воды, введен­ной в эксперименте.

Метод изотопного обмена применим для многих биохимических, диагностических и структурно-функциональных исследований макромолекул, в том числе белков и ДНК.

Литература:
Д. Фрайфельдер, Физическая биохимия, М., Мир, 1982).
О.В. Мосин, Д.А. Складнев, В.И. Швец. Биотехнология. 2001, с. 16-32