Получение дейтерий-меченного инозина

Для получения дейтерий-меченного инозина использовали мутантный штамм B. subtillis (предварительно адаптированный к росту на среде, содержащей максимальные концентрации 2Н2O путём рассева), который вследствие нарушения метаболических путей регуляции биосинтеза пуриновых нуклеотидов продуцирует и выделяет до 20 г инозина на 1 л культуральной жидкости. Иcследуемый штамм проявлял максимальную продуктивность по признаку инозинообразования на богатых ферментационных средах, содержащих в качестве источника углерода и энергии глюкозу (10-12 % от веса), а в качестве источника ростовых факторов и дополнительного источника азота белково-витаминный концентрат (БВК) дрожжей. Ввиду высокой стоимости дейтерий-меченных субстратов, и их малой доступности, было необходимо найти наиболее подходящий природный источник, из которого их можно легко выделять. В качестве такового использовали факультативные метилотрофные бактериии B. methylicum, которые весьма удобны для наработки высокодейтерированных БАС [см. например 8, 9]. Данный штамм метилотрофных бактерий, характеризовался устойчивым ростом и высокими выходами биомассы на среде, содержащей 98 об.% 2Н2О и 2 об.% С2Н3О2Н (см. диаграмму). Именно поэтому мы использовали гидролизаты его биомассы для культивирования штамма продуцента инозина.

При разработке рецептуры питательной среды учитывалось, что метилотрофные бактерии при росте на метаноле способны синтезировать большое количество полноценных белков (до 50% веса сухого вещества) [14], а также некоторое количество полисахаридов (до 10%) [15], причем эта способность сохраняется при росте на средах, содержащих тяжелую воду и дейтеро-метанол. Поскольку продуцент инозина является полиауксотрофным штаммом, нуждающимся для роста в тирозине, гистидине и аденине, было необходимо получать их из гидролизатов биомассы метилотрофных бактерий. Для этого проводили два метода гидролиза биомассы: 1. автоклавирование биомассы метилотрофных бактерий в 0,5 н. растворе 2НCl (в 2Н2O) (30 мин, 08 ати). 2. гидролиз биомассы в 6 н. 2НCl (в 2Н2O) (24 часа, 110 0С). В предварительных экспериментах было показано, что по-первому варианту гидролиза биомассы реализуется гораздо большая питательность суспензии метилотрофных бактерий по-сравнению с гидролизом в 6 н. 2Н2Сl. Поэтому мы отдали предпочтение этому методу проведения гидролиза биомассы.

Количественный и качественный состав аминокислот биомассы метилотрофных бактерий B. methylicum, а также степени дейтерированности аминокислот показаны в таблице. Как видно из данных таблицы, показателем, позволяющим надеяться на высокую эффективность включения дейтерия в синтезируемый продукт служит максимальный уровень дейтерированности аминокислот суммарного белка этих бактерий.

ТАБЛИЦА.

Аминокислотный состав метилотрофных бактерий B. methylicum, полученных в полностью дейтерированной среде dM9 и их уровни дейтерированности.

Аминокислота

Содержание в белке, %

Уровни дейтерированости, %

Глицин

9,69

90,0

Аланин

13,98

97,5

Валин

3,74

50,0

Лейцин

7,33

49,0

изолейцин

3,64

49,0

фенилаланин

3,94

95,0

Тирозин

1,82

92,8

Серин

4,90

86,6

треонин

5,51

не определяли

метионин

2,25

не определяли

аспарагиновая кислота

9,59

66,6

глутаминовая кислота

10,38

70,0

Лизин

3,98

58,9

Аргигин

5,27

не определяли

гистидин

3,72

не определяли

Экспериментально разработанный способ получения дейтерий-меченного инозина представлен на схеме. Его основные этапы: наработка дейтерированной биомассы метилотрофных бактерий B. methylicum путем культивирования бактерий в полностью дейтерированной среде dM9; выделение фракции общих белков биомассы и их гидролиз; ферментация базового штамма B. subtilis на среде, приготовленной на основе 99,9 ат% 2Н2О и гидролизатов биомассы метилотрофных бактерий; выделение инозина, включая его адсорбцию активированным углем, десорбцию спиртово-аммиачным (1:1) раствором и последующую кристаллизацию инозина из метанола. Чистоту полученного инозина контролировали методом тонкослойной хроматографии (ТСХ), используя в качестве сравнения хроматографически чистые стандарты нуклеозидов. ТСХ инозина, выделенного из культуральной жидкости, показала наличие в анализируемом образце единственного пятна с Rf = 0,51, соответствующего по подвижности чистому инозину.