Изучение уровней включения дейтерия в молекулы аминокислот
В настоящей работе уровни включения дейтерия в молекулы аминокислот определяли методом масс-спектрометрии EI MS в виде метиловых эфиров N-Dns-производных аминокислот, за счет сопоставления молекулярных масс протонированных и 2Н-меченых производных аминокислот.
Полученные микробиологическим синтезом 2Н-меченые аминокислоты представляли собой смеси изотопнозамещённых форм молекул, различающихся количеством атомов водорода, замещённых на дейтерий. Вследствие этого эффекта пики молекулярных ионов метиловых эфиров N-Dns-аминокислот в масс-спектрах были полиморфно расщеплены на кластеры за счет примеси молекул с отношениями m/z, больше или меньше детектируемых прибором величин (М)+ с различным вкладом в суммарный уровень дейтерированности. В качестве примера на рис. 4, б приведен масс-спектр смеси метиловых эфиров N-Dns-производных аминокислот полученных со среды с 98 об.% 2Н2О (масс-спектр приведен относительно контрольных условий (а) на обычной воде). Подсчет уровня дейтерированности молекул аминокислот проводили по величине самого интенсивного пика молекулярного иона (М)+, зарегистрированного самим масс-спектрометром; для фенилаланина - шесть (М+ при m/z 418 вместо М+ при m/z 412 для протонированного метилового эфира N-Dns-фенилаланина), для аланина -3.1 (М+ при m/z 339.5 вместо М+ при m/z 336.4), для валина -4.7 (М+ при m/z 369.2 вместо М+ при m/z 364.5), для лейцина/изолейцина -5.1 атома дейтерия (М+ при m/z 383.6 вместо М+ при m/z 378.5). Таким образом, общее количество дейтерия в молекуле фенилаланина составило 75%, аланине -77.5%, валине -58.8%, лейцине/изолейцине 51%. Уровни дейтерированности 2Н-меченых аминокислот семейства лейцина должны быть ниже остальных вследствие того что лейцин добавляли в ростовую среду в протонированном виде, что подтвердилось экспериментальными данными (см. выше). В то же время биосинтез фенилаланина был косвенно связан с ауксотрофностью по лейцину, поэтому дейтеривая метка в молекуле самого фенилаланина также была несколько разбавлена.
Полученные данные в целом подтверждают устойчивое представление о том, что адаптация к 2H2О является фенотипическим явлением, поскольку адаптированные клетки возвращались к нормальному росту и биосинтезу фенилаланина в протонированных средах после некоторого лаг-периода. В то же время эффект обратимости роста на 2H2O/Н2Oсредах теоретически не исключает возможности того, что этот признак стабильно сохраняется при росте в Н2О, но маскируется при переносе клеток на дейтерированную среду. В общих чертах, при переносе клетки в дейтерированную среду она не только постепенно теряет обычную воду за счет насыщения внутриклеточной среды 2H2О, но и происходит очень быстрый изотопный (1Н-2H)-обмен в гидроксильных, карбоксильных, сульфгидрильных и аминогруппах всех биологических макромолекул, включая нуклеиновые кислоты и полипептиды. Затем в процессе роста клетки дейтерий включается в углеродные скелеты макромолекул, образуя связи типа С-2H [17]. В связи с тем, что физико-химические параметры С-2Н связи существенно отличаются от ее протонированного прототипа [18], можно предположить, что клетка реализует лабильные адаптивные механизмы, которые способствуют стабилизации работы макромолекулярных компонентов жизненно-важных систем, которые подверглись дейтерированию. Не исключено, что положительные эффекты, наблюдаемые при адаптации к 2H2О связаны с образованием в 2H2O конформаций 2Н-меченых макромолекул с иными структурно-динамическими свойствами, чем конформаций, образованных с участием водорода, и поэтому имеющих другую активность и биологические свойства, подходящие для работы в 2Н2О. С другой точки зрения пространственная структура 2Н-меченых макромолекул может стабилизироваться в 2H2О за счет вторичного изотопного эффекта дейтерия и действия 2H2О как растворителя (большая структурированность, плотность и вязкость по сравнению с Н2О) [19].
Суммируя полученные для изученного штамма данные, можно сделать вывод об адаптивной стабилизации посредством постепенного привыкания к 2Н2О и как следствие этого улучшения ростовых и биосинтетических параметров. Выбор метилотрофных бактерий в качестве модельных объектов для данных исследований представляется наиболее целесообразным, так как метилотрофы как организмы, реализующие RuMP и сериновый пути ассимиляции MetOH, эволюционно просты и достаточно лабильны в генетическом аспекте и тем самым быстрее реагируют и приспосабливаются к изменчивым факторам среды. В настоящее время аналогичные подходы по адаптации других штаммов метилотрофных бактерий к 2Н2О активно изучаются.
ЛИТЕРАТУРА
1. Мосин О. В., Складнев Д. А., Егорова Т. А., Швец В. И. Методы получения аминокислот и белков, меченных стабильными изотопами 2Н, 13С, 15N, 18О. // Биотехнология. 1996. №10. С. 24-40.
2. Пшеничникова А. Б., Карнаухова Е. Н., Звонкова Е. Н., Швец В. И. Методы получения дейтерированных аминокислот. // Биоорганическая химия. 1995. Т. 21. № 3. С. 163-178.
3. Antony C. Bacterial Oxidation of Methane and Methanol. The Biochemistry of Methylotrophs, 2 nd edn. 1982. Academic Press, London. P. 78
4. Colby J., Dalton H., Whittenbury R. Biological and biochemical aspects of microbial growth on C1 compounds. // Ann. Rev. Microbiol. 1979. V. 33. P. 481-517.
5. Karnaukhova E. N., Reshetova O. S., Semenov S. Y., Skladnev D. A., Tsygankov Y. D. 2H-and 13C-Labeled Amino Acids Generated by Obligate Methylotrophs Biosynthesis and MS Monitoring. // Amino Acids. 1994. V. 6. P. 165-176
6. Складнев Д. А., Мосин О. В., Егорова Т. А., Еремин С. В., Швец В. И. Метилотрофные бактерии - источник изотопномеченых 2Ни 13С-аминокислот. // Биотехнология. 1996. №5. С. 25-34.
7. Daboll H. F., Crespi H. L., Katz J. J. Mass cultivation of algae in pure heavy water. // Biotechnol. and bioengineering. 1962. V. 4. P. 281-297
8. Crespi H. L. Stable isotopes in life sciences. Intern. atomic energy agency, Vienna, 1977. P. 111-121.
9. Мосин О. В., Складнев Д. А., Егорова Т. А., Юркевич А. М., Швец В. И. Изучение биосинтеза аминокислот штаммом Brevibacterium methylicum при росте на средах, содержащих тяжелую воду и дейтерометанол. // Биотехнология. 1996. № 3. С. 3-12.
10. Mosin O. В., Складнев Д. А., Цыганков Ю. Д. Патент РФ 93055824/13 (Ноябрь 17, 1995)
11. Кейл Дж. Лабораторный практикум по химии. Наука. Москва. 1981. С. 56.
12. Miller J. H., Experiments in molecular genetics. 1976. Cold Spring Harbor laboratory Cold Spring Harbor, New York p 393
13. Мосин О. В., Карнаухова Е. Н., Пшеничникова А. Б., Складнев Д. А., Акимова О. Л. Биосинтетическое получение дейтериймеченного фенилаланина, секретируемого метилотрофным мутантом Brevibacterium methylicum. // Биотехнология. 1993. №9. С. 16-20.
14. Мосин О. В., Складнев Д. А., Егорова Т. А., Швец В. И. Масс-спектрометрическая оценка уровня включения 2Н и 13С в молекулы аминокислот бактериальных объектов. // Биоорганическая химия. 1996. Т. 22. № 10-11. С. 856-869.
15. Boer L de, Harder W, Dijkhuizen L Phenylalanine and tyrosine metabolism in the facultative methylotroph Nocardia sp. 239. // Arch. Microbiol. 1988. V. 149. P. 459-465
16. Dijkhuizen L. Metabolic regulation in the actinomycete Amycolatopsis methanolica, a facultative methylotroph employing the RuMP cycle for formaldehyde assimilation. Microbial growth on C1 compounds 1996, Kluwer academic publishers, London, P. 9-15
17. LeMaster D. M. Deuterium labeling in NMR structural analysis of larger proteins. // Quart. Revs. Biophys. 1990. V. 23. №1. P. 133-174.
18. Ереми В. А., Чекулаева Л. Н., Харатьян Е. Ф., Островский Д. Н. Выращивание бактерий Micrococcus lysodeikticus на дейтерированной среде. // Микробиология. 1978. Т. 37. Вып. 4. С. 629-635.
19. Fesik S. W., Zuiderweg E. R. P. Heteronuclear three-dimentional NMR spectroscopy of isotopically labelled biological macromolecules. // Quart. Revs. Biophys. 1990. V. 23. № 1. P. 97-131.